腺病毒(Adenovirus)是無囊膜的線性雙鏈DNA病毒，在自然界分布廣泛。在腺病毒的試驗(yàn)中，腺病毒滴度對(duì)于保持樣品之間的一致性和實(shí)現(xiàn)正確的表達(dá)水平是很重要的，因此我們經(jīng)常需要測(cè)量腺病毒滴度。傳統(tǒng)的終點(diǎn)稀釋試驗(yàn)需要兩周，周期較長，本試劑盒可在48h內(nèi)快速進(jìn)行腺病毒滴度的測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確。

實(shí)驗(yàn)原理

腺病毒可以感染并在AD-293/HEK-293細(xì)胞中復(fù)制，由于腺病毒感染HEK293細(xì)胞后可表達(dá)六鄰體蛋白（腺病毒基因組編碼的衣殼蛋白）,因此可以通過感染的細(xì)胞中的病毒六體蛋白的表達(dá)量來檢測(cè)病毒的載量。本試劑盒包含抗六鄰體蛋白的特異性抗體，用于識(shí)別感染細(xì)胞，經(jīng)過辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗放大信號(hào)，并加入辣根過氧化物酶的底物DAB進(jìn)行染色，使被病毒感染的陽性細(xì)胞變成深棕色。通過計(jì)算給定區(qū)域內(nèi)深棕色/黑色細(xì)胞的數(shù)量來確定感染細(xì)胞的滴度水平，每個(gè)染色細(xì)胞對(duì)應(yīng)一個(gè)感染單位(single infectious unit,ifu)。

本檢測(cè)方法可與1型、2型、5型和6型人腺病毒相兼容，目前已經(jīng)對(duì)基于5型人腺病毒進(jìn)行了驗(yàn)證。

產(chǎn)品組成

未提供的必需品

1.磷酸鹽緩沖液(PBS,pH:7.4)

2.磷酸鹽緩沖液+1%牛血清白蛋白(PBS+1%BSA)

3.12/24孔培養(yǎng)板

4.恒溫培養(yǎng)箱(加濕，5%CO?)

5.顯微鏡(×20倍物鏡)

6.細(xì)胞計(jì)數(shù)器

7.細(xì)胞培養(yǎng)基(如：DMEM+10%胎牛血清+抗生素)

8.甲醇

使用方法

為了較大限度地提高準(zhǔn)確度，每次稀釋的病毒應(yīng)一式兩份檢測(cè)。選取沒有病毒的孔作為陰性對(duì)照，滴度實(shí)驗(yàn)所用感染時(shí)間應(yīng)與后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用感染時(shí)間一致。

感染細(xì)胞

1在培養(yǎng)板中每孔加入1mL健康的對(duì)數(shù)期AD-293或HEK 293細(xì)胞（12孔板：5×105/mL/孔；24孔板：2.5×105/mL/孔），使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，如DMEM+10%FBS+抗生素，確保細(xì)胞均勻分布于孔中，以便準(zhǔn)確測(cè)定滴度，理想情況下，細(xì)胞在感染前傳代不應(yīng)超過6次。

2用PBS或培養(yǎng)基為稀釋液將病毒原液進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋比例為10-2至10-6；

3在兩個(gè)相對(duì)應(yīng)的組織培養(yǎng)孔（步驟1中制備）中分別加入每種病毒稀釋液；

4培養(yǎng)細(xì)胞24-48小時(shí)（37℃,5%CO?）；

5輕輕地抽吸將培養(yǎng)基從細(xì)胞中去除。

6將培養(yǎng)皿置于罩內(nèi)孵育5-10分鐘，使其干燥。

固定與染色

1、加入預(yù)冷的100%甲醇固定細(xì)胞

2、在-20℃下孵育10分鐘

3、抽吸液體，用PBS+1%BSA溶液仔細(xì)洗滌細(xì)胞3次

4、從培養(yǎng)板孔中吸出溶液。然后每孔加入試劑A溶液。37℃孵育1小時(shí)，在振蕩器上搖勻

5、重復(fù)操作3

6、從培養(yǎng)板孔中吸出液體。然后每孔加入試劑B溶液。37°℃孵育1小時(shí)，在振蕩器上搖勻

7、配制1×DAB工作液：取出試劑C,用試劑D 10倍稀釋試劑C(1:9)

8、重復(fù)操作3

顯色并計(jì)數(shù)

1在培養(yǎng)板中每孔加入1×DAB工作液

2室溫孵育15分鐘，或在4°C下孵育過夜，顏色可以增強(qiáng)。

3吸出液體，每孔加入PBS溶液

4使用顯微鏡（×20倍物鏡），隨機(jī)選擇至少三個(gè)區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且計(jì)數(shù)的區(qū)域應(yīng)包含5-50個(gè)陽性（深棕色/黑色細(xì)胞），得出陽性細(xì)胞的平均值，若區(qū)域內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)較少（5-10個(gè)），并假設(shè)感染細(xì)胞孔中隨機(jī)分布，建議您選取更多的區(qū)域(例如6-10個(gè)計(jì)數(shù)，以達(dá)到相同的準(zhǔn)確度。

5計(jì)算每孔的感染單位（ifu/mL）=陽性細(xì)胞數(shù)（區(qū)域）×區(qū)域數(shù)（孔）/病毒樣本體積(mL)x稀釋倍數(shù)

注意事項(xiàng)

1.將試劑C底物DAB (10×)保存在-20℃或以下。若要使用該溶液，請(qǐng)取出使用所需的量，并立即將其放回-20℃。請(qǐng)勿將溶液平衡到室溫

2.若所有細(xì)胞呈陽性(棕色/黑色)則考慮：

1)沖洗步驟不充分；

2）腺病毒原液稀釋不正確或不充分；

3)試劑B稀釋不正確；

4)DAB工作液配制不正確；

5)沒有用PBS+1%BSA溶液仔細(xì)洗滌細(xì)胞3次。

3.若細(xì)胞單層在固定步驟中被破壞或脫落則考慮：

1)小心移動(dòng)培養(yǎng)板，以盡量減少對(duì)細(xì)胞單層的干擾；

2)當(dāng)加入或吸取溶液時(shí)，輕輕地將移液器移到孔的一側(cè)，而不是直接移到細(xì)胞上，以防止破壞細(xì)胞單層；

3)對(duì)病毒原液稀釋的不足可能導(dǎo)致細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿。

本試劑盒僅用于科研和生產(chǎn)過程控制，不能用于人類和動(dòng)物的醫(yī)學(xué)診斷。