脯氨酸蛋白酶是一種胞內外肽酶。它是一種同二聚酶，在其活性位點中需要二價陽離子（如錳）作為輔因子才能發揮其功能。脯氨酸蛋白酶是催化 α-羧基與脯氨酸或羥脯氨酸之間的酰亞胺鍵水解的酶。該蛋白質形成同二聚體，該同二聚體水解具有 C 末端脯氨酸或羥脯氨酸殘基的二肽或三肽。

脯氨酸酶基因的罕見突變會引起缺陷，導致亞氨基二肽尿大量增加，血漿中含脯氨酸的二肽升高、反復感染、智力低下和皮膚損傷。

脯氨酸蛋白酶在脯氨酸的循環利用和膠原蛋白的生產中具有重要作用。